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基因组受体重排技术及其在淋巴组织增生性病变病理诊断中的应用

作者:发布时间:2010/4/26 8:57:36

基因重排检测技术在病理诊断中的应用

 

本课教学目的:

1.使学员通过学习了解基因重排检测技术的一些基本原理、操作过程。

2.使学员掌握基因重排检测技术在病理诊断中的常规应用。

3.使学员能够了解在基因重排检测操作中可能出现的各种问题,并能自己初步独立解决这些问题。

教学重点:

1.基因重排检测技术在病理诊断中的应用。

2.基因重排检测技术操作要点和操作规范。

3.基因重排检测技术常见问题的认识和处理。

难点:

1.如何在淋巴瘤病理诊断中应用好基因重排检测技术。

 

 

基因重排检测技术在病理诊断中的应用

一、基因重排定义(与基因重组区别)

基因重排:通过基因的转座,DNA的断裂错接而使正常基因顺序发生改变。
基因重组: 是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合,形成新DNA分子的过程。也就是说, 基因重排是一个基因内DNA排列发生改变, 而使这个基因改变了,如出现新的基因就是靠这种方法,而基因重组却是几个不同基因互相改变位置, 而使的基因组合改变, 常在遗传上出现, 如子代就是父代经过基因重组然后发育产生的, 这个只会出现新性状而不会产生新基因。

二、基因重排检测技术的原理

B淋巴细胞产生的抗原受体分子IgT淋巴细胞产生的抗原受体分子TCR,其编码基因在细胞的分化过程中均发生重排。通过基因重排,机体产生大量多样的重排构型,编码种类繁多的抗原特异性抗体。但对于一个个体及其后代,只含有其独特的重排构型,也就是说,一个TB细胞或其克隆性后代,均只含一种独特的分子遗传学标记。大量的实验已证实,淋巴细胞肿瘤源于单克隆性增生。我们利用特定的引物对其基因进行扩增,当将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶(或琼脂糖凝胶)电泳时,多克隆淋巴细胞将产生一片弥漫带(见于反应性增生),而单克隆性增殖的淋巴组织则出现一明显条带(见于恶性淋巴瘤)。因此通过检测淋巴组织增生性病变的重排构型可以鉴别淋巴系统的肿瘤性和反应性增生,并确定细胞的来源。

三、基因重排检测技术的目的

1、检测淋巴组织增生性病变的克隆性起源,从而确定该病变性质。

2、确定淋巴系统肿瘤疾病的分型。

3、分析淋巴系统多发性肿瘤的起源同一性问题。

四、基因重排检测技术的操作流程

1、石蜡包埋组织DNA的提取 每例标本制备厚度为4 mm的切6张,贴于载玻片上,常规烤片、二甲苯脱蜡、酒精洗,切片自然干燥。用无菌双面刀片将组织刮入1.5 ml 的离心管中,按传统方法提取基因组DNA

2、引物合成  引物序列由上海生工生物工程技术公司合成。

引物序列为:

β-球蛋白基因内对照

PC03ACACAACTGTGTTCACTAGC      PC04CAACTTCATCCACGTTCACC

免疫球蛋白基因重排(IgH)

FR3AACACGGCTGTGTATTACTGT      LJH TGAGGAGACGGTGACC

VLJHGTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG

T细胞受体基因重排(TCR β链和γ链)

Db1: CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC  Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC

TVG: AGGGTTGTGTTGGAATCAGG       TJX: CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC Vγ11: TCTGGAGTCTATTACTGTGC        Vγ101: CTCACACTCTCACTTC

Jγ12 :CAAGTGTTGTTCCACTGCC          Jp12: GTTACTATGAGCTAGTCC

3PCR 扩增及循环条件 PCR扩增在PT-200型热循环仪(MJ Research)上进行。反应体系为25 µl,含10 mmol/L dNTPGibco BRL2 µl10´缓冲液2.5 µl50 mmol/L MgCl2 0.75 µlTaq DNA聚合酶(Gibco BRL1u20 pmol/L引物1 µlDNA样品1-5 µl

IgH基因采用半巢氏PCR扩增: 第一轮引物为FR3ALJH, 95 ℃预变性3min , 然后94 ℃变性40sec, 62 ℃退火50 sec, 72 ℃延伸40 sec, 30个循环; 最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1:100稀释后取1μl进行第二轮扩增, 引物为FR3AVLJH, 95 ℃预变性3min , 然后94 ℃变性40sec, 60 ℃退火50 sec, 72 ℃延伸40 sec, 30个循环; 最后72 ℃延伸10 minFR 3A VLJH 扩增产物为100 120 bp

TCRβ和TCRγ采用40个循环, 其中TCRγ引物为Vγ11Vγ101Jγ12 Vγ11Vγ101Jp12的混合物。95 ℃预变性3min , 然后94 ℃变性40sec, 56 ℃退火50 sec, 72 ℃延伸40 sec;最后72 ℃延伸10 minTCRβ扩增产物为6585 bpTCRγ各组扩增产物在70200 bp不等。

β-球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠, 40个循环。95 ℃预变性3 min,然后94 ℃变性40sec, 60 ℃退火50 sec, 72 ℃延伸40 sec;最后72 ℃延伸10 min。产物长度为110 bp

4、电泳及结果观察 琼脂糖凝胶(20 g/L)电泳评价扩增效果后,将3 µl产物和等体积的上样缓冲液(990 ml/L甲酰胺,1 g/L溴酚蓝,1 g/L二甲苯青)混匀后加到厚度为0.8 mm的聚丙烯酰胺凝胶(100 g/L,含尿素8 mol/L),应用miniVE系统(Amersham-Pharmacia Biotech)泳动8 h80 V)。取出后进行银染,分别用UVP凝胶分析系统(UVP, CambridgeUK)和光学照相记录数据,根据IgH TCR相应阳性位置判断结果.

五、 基因重排检测技术的结果判定  

阳性结果判定标准:(1)PCR扩增电泳条带清晰,宽度不大于1mm,边缘锐利;(2)片段大小与预计范围相符,与期望值相差不超过5bp(3)若出现期望值大小之外的其它条带或期望值内出现两条或以上可接受的条带,应判定为重排阴性。

六、基因重排检测技术的主要应用

(一)、淋巴组织增生性病变性质的确定:

     淋巴组织增生性疾病的诊断一直是组织学诊断中的难点,细胞形态异型性明显和生物学行为明显恶性的淋巴组织增生性病变诊断起来比较容易,一些具有明显TB细胞表达优势的淋巴组织增生性病变通过免疫组化检测也能很好的做出诊断。但对于一些T细胞和B细胞均没有明显优势表达,而且异型性不明显的淋巴组织局灶性增生性病变疾病的诊断单纯依靠组织形态学和免役组化很难做出诊断,对于这种交界性病变,基因重排检测可以作为重要的辅助诊断手段在淋巴瘤的诊断中起到重要作用。一直是组织学诊断中的难点,免疫组化检测可以明确一部分淋巴组织增生性病变的性质。Kappa链和 Lambda链结果可以明确病变是否为B淋巴细胞起源以及是否为肿瘤性增生,CD20CD79а标记B淋巴细胞及其来源肿瘤,CD3CD45RO标记T淋巴细胞及其来源肿瘤,CD15CD30可以标记何杰金淋巴瘤中的R-S细胞。BCL-2在滤泡性淋巴瘤中通常表达阳性。

(二)、淋巴组织起源肿瘤的分型:

    在淋巴瘤的分型中,免疫组化检测占据重要地位。CD20CD79а标记B淋巴细胞及其来源肿瘤,CD3CD45RO标记T淋巴细胞及其来源肿瘤,CD15CD30可以标记何杰金淋巴瘤中的R-S细胞。但是对于少部分TB细胞均没有明显优势表达的病例,可以通过基因重排检测来进行肿瘤的诊断和分型。

(三)、多发性淋巴组织肿瘤起源同一性问题分析:

    对于多发性淋巴组织起源肿瘤,可以通过检测各个肿瘤是否具有相同的基因重排而确定这些肿瘤是否是同一起源。

七、基因重排检测技术常见问题及解决办法

1、假阳性:由于不同个体组织内克隆斑确实存在差异,所以对于小病变病例基因重排检测必须考虑到这一影响。多处取材重复实验可以减少克隆斑对实验结果的影响。

2、假阴性:将肿瘤组织从蜡块中分离出来,应该保证没有杂质细胞的污染,激光显微切割系统的应用将根本解决这一问题。

     

复习题:

1、基因重排检测技术的基本原理是什么?

2、基因重排检测技术在病理诊断中的应用有那些?