原位杂交技术及其在病理诊断中应用

作者:发布时间:2010/4/26 9:04:30

浅谈原位杂交技术及其在病理诊断中的应用

 

 

一、核酸分子杂交

1953年,Watson, CrickChargaff法则及X线衍射工作基础上提出DNA的双螺旋结构模型。

1.DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链组成

腺嘌呤 A胸腺嘧啶 T尿嘧啶 U鸟嘌呤  G胞嘧啶 C

AT之间形成两个氢键,GC之间形成三个氢键。

两条DNA链相互结合以及形成双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。碱基的相互结合具有严格的配对规律,即腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)结合,鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)结合,这种配对关系,称为碱基互补。

2.变性

核酸在理化因素作用下,双螺旋结构破坏称核酸变性。

根据变性因素区分为碱变性、热变性等。

3.复性

变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程,称复性。

DNA加热变性后,若经骤然降温,互补链碱基之间来不及配对互补,形成氢键联系,两链维持分离状态。但是将变性的DNA缓慢冷却时,可以复性。

二、杂交  (hybridization)

1.定义

当不同来源的核酸变性后一起复性时,只要这些核酸分子中含有相同序列的片段,即可形成碱基配对,出现复性现象,形成杂种核酸分子,或称杂化双链,称核酸分子杂交。

具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链:DNA/DNARNA/DNARNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA

2.杂交分类

northern印迹杂交  核酸提取,杂交,鉴定特定的RNA片段

 

southern印迹杂交  核酸提取,杂交,鉴定特定的DNA片段

 

菌落原位杂交    裂解细菌释放DNA,进行杂交

三、原位杂交

1. 定义

原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization  ISH)是应用特定标记的已知核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体,杂交信号可以在光学显微镜或电子显微镜下进行定位不破坏细胞结构,确定目的序列在胞内空间位置,这一点具有重要的生物学和病理学意义。

在组织切片、细胞涂片及染色体制片上对核酸(mRNADNA)进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法。

用原位杂交术,可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的表达基因的存在与定位。

可进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。

具有灵敏、特异、直观等优点。

2. 原位杂交技术的发展

1969年美国耶鲁大学GallPardue首先创立的,他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交,确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。

1970年,Orth应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交,首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。

1981年,Bauman等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交,然后用荧光显微镜观察获得成功。

    1982年,Shroyer报道用24二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针,使该DNA探针具有抗原性,然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后的探针,最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂交信号。

1983年,Brigat首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA,通过生物素与抗生物素结合,过氧化物酶抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。

1987年,Boeringer Mannhem Biochemisca将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场,和其它非放射性标记物一样,地高辛较放射性标记系统安全,方便、省时间。

3. 原位杂交技术的原理

原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下,使具有特异序列的探针通过碱基互补规则与组织切片或细胞内待测核酸(RNADNA)片段复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位,并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。

4. 探针的种类

l         同位素标记探针

放射性同位素放射出的射线作作于感光乳胶的卤化银晶体,从而产生潜影。再通过显影把感光的卤化银还原成黑色金属银颗粒,根据黑色的部位和黑度,来判断样品中放射性物质分布的位置和强度。

    常用的同位素标记物有3H35S125I32P。同位素标记物虽然有灵敏性高,背底较为清晰等优点,但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害,近来有被非同位素取代的趋势。

l         非同位素标记探针

生物素标记探针

地高辛标记探针

荧光素标记探针

l         DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针。

cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。

5. 原位杂交技术的基本操作

①杂交前准备

l         保持细胞结构,最大限度地保持细胞内DNARNA的水平

l         增强组织的通透性和核酸探针的穿透性使探针易于进入细胞或组织

l         常规石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、细胞涂片和培养细胞爬片等

l         稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂Triton X-100、酒精

l         某些消化酶:胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶等

l         预杂交是减低背景染色的一种有效手段,预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的,从而减低背景染色。

②杂交

l         杂交在ISH整个实验中可被认为是“短兵相接”的一步。杂交是将杂交液滴于切片组织上,加盖硅化的盖玻片

l         杂交前的一切准备工作如增加组织通透性都是为了在杂交这一步骤中核酸探针能进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。因此,杂交是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质,光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触,盖玻片自身有一定重量能与有限的杂交液吸附达到覆盖和防止蒸发的作用。

l         DNA探针或细胞内靶核苷酸为DNA的,则必须在8095℃加热使其变性,时间515min,然后在冰上搁置1min,使之迅速冷却在3742℃孵育杂交过夜。

I.  探针的浓度

最佳原则为应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的。

II. 探针的长度

一般应用于ISHH探针的最佳长度应在50100个碱基之间。探针短则易进入细胞,杂交率高,杂交时间短。

III. 杂交的温度和时间

实际采用的原位杂交的温度在Tm-25℃左右,即比Tm减低25℃,大约在3060℃之间,根据探针的种类不同,温度略有差异。

从理论上讲,核苷酸杂交的有效反应时间在3h左右。

为稳妥起见,一般将杂交反应时间定为1620h,或为简便起见杂交孵育过夜。

③杂交后处理

杂交后处理包括系列不同浓度,不同温度的盐溶液的漂洗,其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针,降低背景染色, 增加信/噪比。

共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是在漂洗的过程中,切勿使切片干燥。

④显色  

根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。

l         非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色,然后利用显微分光光度计或图像分析仪对显色强度进行检测。

l         放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪检测银粒的数量和分布的差异。

四、原位杂交技术的应用

1. 乳腺癌 HER-2 的诊断

l         乳腺癌是最常见的人恶性肿瘤之一,约占妇女全部癌症的1/4

l         乳腺癌发现越早,治愈的可能性就越大。每月一次的乳房自查,如发现异常应及时到专科医院做进一步专业检查,以便做到早发现、早诊断和早治疗。

l         HER-2是一种原癌基因,该基因编码一种跨膜糖蛋白HER-2,参与调控细胞的生长、增殖及分化,是公认的重要肿瘤分子标志之一。

l         Herceptin(贺赛汀)是一种针对HER-2/neu原癌基因产物的人/鼠嵌合单抗,能特异地作用于HER-2受体过度表达的乳腺癌细胞。

l         1998年被美国FDA批准上市,无论单药还是与化疗药物合用治疗HER-2/neu过度表达的乳腺癌均取得了明显疗效。

HER-2基因的橘红荧光信号

17号染色体的绿色荧光信号

     每片计数20个间期细胞核的荧光信号,算出红色信号∶绿色信号比率的均值,以信号比率≥2.0判定为HER-2基因扩增。荧光原位杂交结果的判定借助于对荧光的颜色判断和信号计数,客观地量化了检测地结果。最大限度的降低操作者和检测者的主观因素,确保结果的准确性。

2. 人乳头状瘤病毒检测

    1990年,全世界共有大约47万位宫颈癌患者,是女性最常见恶性肿瘤的第三位。每年大约有23万名女性死于该病。

    全国有关调查表明,我国宫颈癌死亡率排在总癌症死亡率的第四位,占女性癌症的第二位。99.8%的宫颈癌患者中可以检测到HPV,而HPV阴性者几乎不会发生宫颈癌。进行HPV检测并准确分型对官颈癌和癌前病变的预防和治疗甚为重要。

    迄今已发现HPV120多种基因型,分为高危型与低危型。高危型HPV主要与宫颈癌和宫颈上皮内瘤变的发生发展有关。低危型HPV主要引起宫颈非特异性炎症或尖锐湿疣。

    目前我科开展HPV6/11,16/18的原位杂交检测,该项检测灵敏度高,特异性强,定位准确。可以及早发现HPV感染和癌前病变,尽早锥切治疗,对于预防宫颈癌具有非常重要的意义。

3.

    21号染色体三倍体引起的Down综合症使得患者发育迟缓、智力低下和特殊面容。患儿眼距宽,鼻梁低平,眼裂小,舌常伸出口外,身材矮小,骨龄常落后于年龄,头发细软而较少;四肢短,手指粗短,小指向内弯曲。

    因此,有必要在出生前对胎儿进行产前诊断,及时发现异常胎儿,并辨明胎儿所患染色体疾病的种类,从而采取相应的措施。

    应用21号染色体特异位点DNA探针,观察间期细胞中21号染色体的畸变情况。