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分子克隆性分析技术及其在病理诊断中的应用

作者:发布时间:2010/4/26 9:06:24

克隆性分析技术及其在病理学诊断中的应用

教学目的:

1  了解克隆性分析技术原理;

2  掌握克隆性分析技术的概念及其在病理诊断中的应用

   克隆性分析技术的建立和发展:

                     1976, Fialkow 等最早以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因多态性的同工酶分析建立克隆性检测;

                     1980, Bostein等发现许多基因存在着限制内切酶酶切位点的多态性.用相应的内切酶处理后,产生长度不同的DNA片段, 称为限制性片段长度多态性(RFLP),利用这一特性,可区分两个等位基因;

                     1985~1987, Vogelstein首先应用次黄嘌呤核苷转移酶和磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的多态性结合放射性同位素标记的核酸杂交进行克隆性分析(多态性发生率为30%)

                     1991,Gilliland等把上述PGK位点上RELP检测与聚合酶链反应(PCR)技术结合起来,建立起以PCR为基础的克隆性检测方法;

                     1992年,Allen等根据女性X染色体失活的嵌合性(Lyon,1972)AR外显子A中的RELP及其上游100-bp处有甲基化位点(CpG岛)的特点建立起以AR位点克隆性分析技术(其多态性发生率达90%);

                     1992, Hendricks 等建立了单胺氧化酶(MAOA)基因位点的克隆性检测(多态性发生率为75%)

二 以PCR基础的克隆性检测优点

1方法简便;

2不必使用放射性同位素;

3所需样本量少,100个以上的细胞即足够,并可通过与显微切割技术相结合,分析较小的结节性乃至局灶性病变组织的克隆性;

4 可应用病理档案组织进行回顾性研究.

三 克隆性分析技术的概念、前提及其分类

  (一)概 念

是指用于检测一个病变是否是克隆性增生的技术,是区别肿瘤性增生和反应性增生的关键。

  (二)前提条件

    (1)同一组织中不同细胞具有不同的基因型和表型,这些特征用适当方法显示出来;

       (2)分析的靶位点必需稳定,不因细胞传代及亚克隆形成而明显改变;

(三)分类

(1) 淋巴细胞表型及基因型的分析;

  (2) 病毒整合位点的分析;

  (3) 体细胞突变位点的检测;

     (4) 基于女性X染色体失活的嵌合性。

四 基于女性X染色体基因多态性的克隆性分析原理

(一)女性体细胞X染色体失活的嵌合性及多态性;

(二)AR位点克隆性检测原理示意图。

五 克隆性检测实验步骤

(一)标本处理         

       新鲜标本(-70)

        福尔马林固定标本;

       (体积大约为1.0x1.0x0.5cm3)

        石蜡包埋组织(10µm厚蜡片10张)。

(二)DNA提取

    1. 等体积酚氯仿抽提;

     2. 试剂盒(QIAGEN)

()多态性筛选     

     对提取的DNA分别进行PGKAR位点的聚合酶链反应(PCR)扩增,BstXI酶切并2%琼脂糖电泳或10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,确定多态性

()克隆性检测

     对多态性的标本用对甲基化敏感的酶HhaIHpaII37℃水浴锅内进行消化,65℃灭活,巢式PCR扩增,2%琼脂糖或10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

()结果分析及统计  

六 克隆性分析技术在病理诊断中的应用

1协助鉴别反应性增生和肿瘤性增生;

2探讨同一肿瘤不同瘤结节的关系以及帮助明确转移瘤的起源;

3 探讨混合性肿瘤中不同组织成分之间的关系

4 探讨各种癌前或癌相关病灶及结节的克隆性。

七 克隆性检测的意义

                    探讨病变的克隆起源,以区别是否为肿瘤,对于肿瘤的研究、诊断和治疗具有重要的意义;

                    可分析进展期肿瘤的克隆性组成、多结节性病变和混合性肿瘤中不同组织成分之间的关系以及鉴别肿瘤的原发灶与转移灶、复发灶。

八 克隆性检测注意事项

1肿瘤中间质细胞和炎细胞的污染;

2克隆斑:指基因型相同的一组细胞存在于正常组织中并相互镶嵌,呈马赛克样排列(直径一般小于0.3 cm)

3灭活带型的偏移,即有活性Xp与带有活性Xm细胞之间的比例严重偏离 1:1

     总之 ,克隆性检测时必须取瘤周正常组织作对照。

复习要点

    克隆性分析技术的概念及其在病理诊断中的应用