免疫组织化学技术及其在病理诊断中的应用

作者:发布时间:2010/4/26 9:06:50

免疫组化技术在病理诊断中的应用

 

本课教学目的:

1.使学员通过学习了解免疫组化技术的一些基本原理、操作过程。

2.使学员掌握免疫组化技术在病理诊断中的常规应用。

3.使学员能够了解在免疫组化操作中可能出现的各种问题,并能自己初步独立解决这些问题。

教学重点:

1.免疫组化技术在病理诊断中的应用。

2.免疫组化技术操作要点和操作规范。

3.免疫组化技术常见问题的认识和处理。

难点:

1.如何应用好免疫组化技术。

 

免疫组化技术在病理诊断中的应用

一、定义

免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)

二、抗原 (antigen)

是一类在合适条件下,能激发机体免疫系统发生免疫应答,并能与免疫应答产物发生效应的物质。上述应答产物包括抗体和效应细胞,前者主要介导体液免疫,后者主要介导细胞免疫。免疫组织化学主要是应用的上述体液免疫反应,即抗原-抗体反应。

三、抗体(antibody)

抗体是受到抗原刺激后,通过体液免疫应答,B淋巴细胞活化、增殖并形成浆细胞,浆细胞产生和分泌能与相应抗原特异结合的物质,是免疫球蛋白(Ig)的主要组成成份。每个Ig分子由2个轻(L)链和2个重(H)链分子构成,由二硫键连结成分叉状结构。主要包括1、上皮性标记抗体2、间叶组织标记抗体
3
、淋巴细胞标记物4、神经组织标记的抗体5、内分泌受体抗体6、病毒抗体
四、操作流程( SP法)

1)脱蜡、水化;

2PBS23次各5分钟;

33%H2O280%甲醇)滴加在组织切片上,室温静置10分钟;

4PBS23次各5分钟;

5)抗原修复;

6PBS23次各5分钟;

7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。

8)滴加Ⅰ抗50μl,室温静置1小时或者4过夜或者371小时。

94过夜后需在37复温45分钟。

10PBS3次各5分钟;

11)滴加Ⅱ抗4050μl,室温静置,或371小时;

12II抗中可加入0.05%tween-20

13PBS3次各5分钟;

14DAB显色510分钟,在显微镜下掌握染色程度;

15PBS或自来水冲洗10分钟;

16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化;

17)自来水冲洗1015分钟;

18)脱水、透明、封片、镜检。

五、主要应用

(一)、提高病理诊断的准确性

例如,来源不明的淋巴结肿瘤,通过免疫组化反应显示其表达细胞角蛋白(CK),证明为转移癌;如果甲胎蛋白也是阳性,则表明是肝癌转移;如果波形蛋白、S100蛋白及HMB45阳性,CK阴性,则为恶性黑色素瘤;如果淋巴细胞共同抗原,CD20CD45R0阳性,则分别为B细胞性或T细胞性淋巴瘤。

(二)、恶性淋巴瘤的诊断、鉴别诊断和功能分类;

    淋巴组织增生性疾病的诊断一直是组织学诊断中的难点,免疫组化检测可以明确一部分淋巴组织增生性病变的性质。Kappa链和 Lambda链结果可以明确病变是否为B淋巴细胞起源以及是否为肿瘤性增生,CD20CD79а标记B淋巴细胞及其来源肿瘤,CD3CD45RO标记T淋巴细胞及其来源肿瘤,CD15CD30可以标记何杰金淋巴瘤中的R-S细胞。BCL-2在滤泡性淋巴瘤中通常表达阳性。

(三)、应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤;

    癌胚抗原(CEA)对胃肠道癌、甲胎蛋白(AFP)对肝癌和卵巢内胚窦癌诊断有帮助;

(四)、确定同一肿瘤中的多种成分;

    有些肿瘤比如畸胎瘤、癌肉瘤,肿瘤成分复杂多样,肿瘤细胞来源不一,可以通过免疫组化检测,确定各种肿瘤细胞的来源,从而有利于肿瘤的病理学诊断和组织学确定。

(五)、研究某些癌症与病毒的关系;

    癌症的发病率逐年升高,癌症患者越来越多,对于癌症发生、发展、转归的研究越来越多,其中对于癌症与病毒关系的研究越来越受到专家的重视,如肝癌与乙型肝炎病毒、鼻咽癌与EB病毒、宫颈癌与乳头状瘤病毒等的关系;

(六)、激素受体检测-为肿瘤治疗的选择提供依据;

 这项检测可以帮助我们了解乳腺癌等肿瘤是否为雌激素依赖性。如果是,则加用雌激素受体拮抗剂,可明显改善治疗效果及病人的预后。比如乳腺癌检测雌、孕激素受体(ERPR)呈阳性时,应用他莫昔芬(三苯氧胺)治疗可预期获得较好的疗效;

(七)、检测癌基因和抑癌基因蛋白产物(如c-erbB2p53)、增生活性抗原(如Ki-67PCNA)用来估计肿瘤的预后。

(八)、耐药基因检测

    化疗是对肿瘤进行治疗的很重要很有效的手段,但是化疗中存在最大的问题就是肿瘤病人对于药物的耐受性,免疫组化的发展可以通过对肿瘤耐药基因的检测确定患者个体对药物的耐受性,从而指导临床用药。比如多药耐药基因蛋白(P-gp)阳性提示患者可能对阿霉素、柔红霉素、长春新碱、VP16等药耐药,从而可以指导或建议临床医师用药。

(九)、肿瘤靶向药物治疗靶点的检测

    肿瘤化疗是对肿瘤特别是不能手术肿瘤患者较好的治疗方案,但药物对肿瘤的敏感性一直是治疗疗效好坏的关键。特定分子靶向治疗药物可针对性对特定肿瘤进行治疗,但是这些药物只是针对部分具有特定靶向位点的患者,而且医疗费用昂贵,因此必须准确筛选疗效敏感的病人。通过分子靶向治疗靶点的病理学检测可以筛选适于应用分子靶向治疗药物的患者,从而对患者个体化治疗提供理论依据。比如通过检测乳腺癌HER-2阳性,可以应用Herceptin 治疗。

(十)、免疫性疾病的诊断

    例如,多种肾小球肾炎或肾病的发生与抗原-抗体复合物在肾组织不同位置的沉积有关,因此在切片上检测Ig及补体等成份的沉积程度和形态有助于不同肾脏疾病的分类。

(十一)、病原微生物的检测

诸如种类型的病毒性肝炎、出血热、EB病毒感染、巨细胞病毒感染以及人乳头状瘤病毒感染的诊断都需要进行病原体的免疫组织化学检查。这种病原学检查是病理诊断的基础。

六、免疫组化常见问题及解决办法

1、染色过强或全片着色

2、 切片边缘着色

3、半边着色

4、灶片状着色

5、 间质着色

6、 细胞浆着色

7、 细胞核着色

思考题:

1.免疫组化技术在病理诊断中的应用有哪些?